Разработка клинико-биохимической системы диагностики, прогнозирования и коррекции поражений роговицы, индуцированных кераторефракционными операциями 14. 00. 08. Глазные болезни 03. 00. 04. Биохимия

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Клиническая характеристика пациентов, распределение по группам

На базе ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза»» обследованы 236 пациентов (460 глаз) с эмметропией, различными аномалиями рефракции (миопия и гиперметропия) и осложнениями КРО, которые в соответствие с задачами исследования и этапами его выполнения были разделены на группы.

I этап. Контрольные неоперированные группы. Критерии включения: аметропия или эмметропия с исходно неизмененной роговицей. 3 группы по 20 человек (40 глаз): К_Е - с эмметропией; К_М - с миопией; К_Нm – с гиперметропией.

II этап. Основные оперированные группы. Критерии включения: аметропия, исходно неизмененная роговица.

IIa – первая основная группа - пациенты c типичным послеоперационным периодом. Исходя из вида аметропии и КРО, была разделена на 3 подгруппы: 1а – 34 пациента (68 глаз) с миопией и ЛАЗИК; 1б – 31 пациент (62 глаза) с миопией и ФРК; 1в – 18 пациентов (32 глаза) с гиперметропией и ЛТК.

IIб - вторая основная группа – пациенты с атипичным послеоперационным периодом. Исходя из вида аметропии и КРО, была разделена на 3 подгруппы: 2а – 21 пациент (38 глаз) с миопией и ЛАЗИК; 2б – 17 пациентов (31 глаз) с миопией и ФРК; 2в – 5 пациентов (9 глаз) с гиперметропией и ЛТК.

III этап. Основная оперированная группа. Критерии включения: миопия, исходно измененная роговица (неоваскулярная кератопатия при ношении контактных линз, перенесенные КРО (радиальная кератотомия, ФРК, ЛАЗИК)) - третья основная группа: 50 пациентов (100 глаз).

Группы были сопоставимы по половому и возрастному критериям.

Скрининговая система исследования функционального слезного комплекса (ФСК): тест Ширмера-1(ТШ-1) – оценка суммарной слезопродукции. Интерпретация: >25 мм за 5 минут – гиперсекреция СЖ; 15 – 25 мм – нормосекреция; 10 – 15 мм – пограничное состояние; 10 мм – гипосекреция; тест Ширмера-2(ТШ-2) (модификация Jones)- оценка базальной слезопродукции. Ноpма: >10 мм за 5 минут; время разрыва слезной пленки (ВРСП) (проба по Норну) – исследование стабильности слезной пленки (СП). Интерпретация: 15 - 45” – норма; 10 - 15” - пограничные значения, 10” - нестабильность СП; оценка состояния эпителия роговицы (ОСЭР) – раствор флюоресцеина, инстилированный в конъюнктивальную полость, выявляет эпителиальные дефекты. Степень поражения эпителия в каждой из 5 условных зон роговицы (центральная, верхняя, нижняя, латеральная и медиальная) оценивалась по 4-бальной шкале: 1 – единичные точечные окрашивания эпителия; 2 – локальное окрашивание до 1/3 площади зоны; 3 – окрашивание от 1/3 до 1/2 площади зоны; 4 – более 1/2 площади. Баллы в каждой зоне суммировались. Максимальная оценка – 20 баллов.

Исследование биохимического состава слезной жидкости

СЖ собирали из нижнего конъюнктивального свода микропипеткой со съемными стерильными наконечниками без стимуляции слезоотделения. Биохимические анализы СЖ проводили на автоматических анализаторах «Express Plus» (США) и «Hitachi-912» (Франция). Изучали показатели: белкового и пуринового обмена: содержание общего белка колориметрическим биуретовым методом (Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.I. et al, 1957); мочевины - кинетическим уреазно-глутаматдегидрогеназным методом (Bergmeyer H.U., Beutler H.O., 1985); мочевой кислоты - колориметрическим методом с уриказой и пероксидазой (Bergmeyer H.U., 1974); активность γ-глутамилтранспептидазы - фотометрическим кинетическим методом (Szasz G., 1969); энергетического и углеводного обмена: содержание глюкозы - гексокиназным УФ-методом (Bergmeyer H.U., Bernt E., Schmidt F. et al, 1974); активность лактат-дегидрогеназы (ЛДГ) - оптимизированным УФ-методом (Wrόblewski F., La Due J.S., 1955); α-амилазы - колориметрическим методом (Henkel E., Stepert U., 1985); креатинфосфокиназы (КФК) - оптимизированным УФ-методом (Empfehlungen der Deutcshen Geselsehaft fur Klinische Chemie, 1977); липидного обмена: содержание холестерина и триацилглицеридов - колориметрическим методом (Schettler G., Nuessel E., 1975); антиоксидантной защиты (АОЗ) и свободно-радикального окисления (СРО): содержание малонового диальдегида (МДА) - с тиобарбитуровой кислотой (Стальная Н.Д., Гаришвили Г.Г., 1977); активность Cu, Zn-супероксиддисмутазы (СОД) - по степени ингибирования супероксид-анион-зависимой реакции (Fridovich I., 1975); каталазы – по степени превращения пероксида водорода под действием каталазы в воду и кислород (Luek A., 1965).

Конфокальную микроскопию (КМ) роговицы проводили на приборе Confoscan 4 (Nidek, Japan) после инстилляции местного анестетика («Инокаин») через иммерсионный гель («Видисик»). Использовали автоматический режим сканирования роговицы, мануальный режим визуализации корнеальных структур, функцию автоматического подсчета плотности эндотелиальных клеток с оценкой полиморфизма и размера клеток и оптическую пахиметрию (с помощью Z-ring).

У пациентов контрольных групп диагностический комплекс проводился однократно, у пациентов основных групп – до и после операции в различные контрольные сроки от 1 часа до 12 месяцев.

Все пациенты были прооперированы ведущими офтальмохирургами эксимерлазерного отделения Центра Лазерной Хирургии ФГУ «МНТК «Микрохирургия глаза»» по стандартным технологиям.

Статистическая обработка: с помощью программ STATISTICA 5.0 (StatSoft A); модуль - ос­новные статистики (Basic statistics/Tables).

Результаты собственных исследований

I этап: установление исходных значений показателей ФСК, биохимического состава СЖ и ультраструктуры роговицы

Анализ показателей ФСК и биохимических маркеров СЖ у пациентов контрольных групп и первой основной группы до операции установил, что величины изучаемых параметров при аметропии не имеют статистических значимых отличий от данных при эмметропии (p>0,1).

При КМ у всех пациентов контрольных и первой основной группы до операции получены изображения интактной роговицы без признаков клеточной активации (рис. 1 а-з).

а

б

в

г

д

е

ж

з

Рис.1 Конфокальная микроскопия интактной роговицы: а - клетки поверхностного эпителия; б – крыловидные эпителиоциты; в – клетки базального эпителия; г - нервные волокна субэпителиального сплетения; д - стромальный нервный ствол; е - кератоциты поверхностной 1/3 стромы; ж - кератоциты глубокой 1/3 стромы; з - эндотелий

II этап: изучение динамики показателей в послеоперационном периоде КРО

IIа – типичное послеоперационное течение КРО изучали у пациентов 1-ой основной группы с помощью исследования комплекса функциональных, метаболических и морфологических показателей от 1 часа до 12 месяцев после КРО (ЛАЗИК, ФРК, ЛТК).

Динамическое исследование показателей ФСК после КРО позволило получить следующие результаты:

- ТШ-2 можно проводить после биомикроскопически завершенной эпителизации (из-за вероятности эпителиотоксического воздействия местных анестетиков: ЛАЗИК – не ранее 3 часов, ЛТК, ФРК – не ранее 48 часов после операции). Выраженное рефлекторное слезоотделение в раннем послеоперационном периоде КРО искажает результаты ТШ-2 и ВРСП;

- ранний послеоперационный период (до 3 суток) сопровождался увеличением рефлекторной слезопродукции (ТШ-1), максимально выраженной при ФРК (27,9±3,4 мм), которая сменялась гипосекрецией (начиная с 7 суток: максимально выраженной при ЛАЗИК - 16,2±0,5 мм); нормализация ТШ-1: к 6 (ФРК, ЛТК), 8 месяцам (ЛАЗИК) после операции;

- динамика ТШ-2 в целом повторяет ТШ-1: гипосекреция, начиная с 2-3 суток послеоперационного периода, максимально выраженная при ЛАЗИК (5,8±0,2 мм) и постепенное восстановление базальной слезопродукции к 3-му (ЛТК), 6-му (ФРК) и 8-му (ЛАЗИК) месяцам после операции;

- максимальное поражение эпителия роговицы отмечалось при ФРК и ЛТК (12,3±0,7 и 11,8±1,7 баллов), с нормализацией к 3 месяцам после операции.

Таким образом, исследование показателей ФСК позволяет проводить быструю (до 15 мин) скрининговую оценку грубых изменений глазной поверхности и слезопродуцирующего аппарата.

Результаты динамического исследования показателей ФСК у пациентов после различных видов КРО отражены на рисунке 2 (а-г).

время

время

До

операции

1 1 2-3 7 14 1 3 6 8 12

час с у т к и м е с я ц ы

До

операции

2-3 7 14 1 3 6 8 12

с у т к и м е с я ц ы

- ЛАЗИК - ФРК - ЛТК

время

время

До

операции

До

операции

2-3 7 14 1 3 6 8 12

2-3 7 14 1 3 6 8 12

время

с у т к и м е с я ц ы

с у т к и м е с я ц ы

Рис. 2.Динамика показателей ФСК у пациентов после различных видов КРО: а – тест Ширмера-1 (ТШ-1), б – тест Ширмера -2 (ТШ-2), в – время разрыва слезной пленки (ВРСП), г – оценка состояния эпителия роговицы (ОСЭР).

Динамика наиболее значимых биохимических показателей СЖ после различных видов КРО представлена в таблицах 1-3.

Таблица 1. Динамика биохимических показателей СЖ у пациентов после операции ЛАЗИК, M±σ

Таблица 2. Динамика биохимических показателей СЖ у пациентов после операции ФРК, M±σ