Автореферат диссертации на соискание ученой степени

26

На правах рукописи

ЦФАСМАН

Татьяна Михайловна

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ХОЛОДОАДАПТАЦИИ И РЕВЕРСИЙ К TS+ ФЕНОТИПУ ВИРУСОВ ГРИППА А И В

03.02.02 – вирусология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2010

Работа выполнена в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук

Маркушин Станислав Георгиевич

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор

Каверин Николай Вениаминович

Доктор биологических наук

Гамбарян Александра Сергеевна

Ведущая организация:

НИИ гриппа СЗО РАМН

Защита диссертации состоится «23» сентября 2010 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д. 5а

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Автореферат разослан «___» ___________ 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат биологических наук

Ирина Владимировна Яковлева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность проблемы.

Живые гриппозные вакцины создают на основе холодоадаптированных (ХА) штаммов вируса гриппа. Основными фенотипическими маркёрами, которые характеризуют аттенуацию ХА штаммов (в конечном итоге, их апатогенность для людей), являются са и tsфенотип, т.е. способность к эффективной репродукции при пониженной (260С) и неспособность к репродукции при повышенной (39-400С) температуре. Считается, что са, ts и аттенуированный (att) фенотип ХА штаммов стабилен благодаря совокупности мутаций, приобретённых этими штаммами в процессе адаптации к пониженной температуре, в генах PB2, PB1, PA, NP, M1/M2 и NS1/NS2 [Александрова Г.И. и Климов А.И., 1994; Ambrose C.S. et al., 2008].

Несмотря на то, что живые гриппозные вакцины на основе ХА штаммов в течение многих лет используются в России и в США, механизмы адаптации вирусов гриппа к пониженной температуре до сих пор изучены недостаточно. Исследования показали, что популяция ХА штамма А/Ленинград/134/17/57, используемого для производства живой гриппозной вакцины в России, гетерогенна и состоит из вариантов с различным набором мутаций. Этот факт может затруднять изучение механизмов аттенуации данного штамма.

Роль отдельных генов в аттенуации ХА штаммов исследована лишь для четырёх штаммов, которые используются для производства вакцины: А/ЭннАрбор/6/60, B/ЭннАрбор/1/66, А/Ленинград/134/17/57 и В/СССР/60/69 [Hoffmann E. et al., 2005; Jin H. et al., 2003; Jin H. et al., 2004; Kiseleva I. et al., 2004; Kiseleva I. et al., 2010]. Только для двух штаммов – А/Ленинград/134/17/57 и А/Ленинград/134/47/57, полученных на основе одного и того же родительского штамма – известно, какие именно мутации произошли в процессе адаптации этих штаммов к пониженной температуре (для остальных штаммов достоверно неизвестны соответствующие предковые дикие штаммы, с которыми можно было бы провести сравнение) [Медведева Т.Е. и др., 1991; Ghendon Y. et al., 1984; Herlocher M.L. et al., 1993; Klimov A. et al., 1992].

До сих пор остаётся неясным, есть ли какие-либо закономерности, касающиеся появления мутаций в определённых участках генома ХА штаммов вируса гриппа. Неизвестно, существуют ли определённые локусы, в которых возникают мутации при адаптации вирусов гриппа к пониженной температуре или сходный фенотип ХА штаммов может быть обусловлен различным сочетанием мутаций в разных генах.

Проблема различия темпов накопления мутаций вирусами гриппа А и В в процессе адаптации к пониженной температуре и обратной адаптации ХА штаммов к повышенной температуре требует дальнейшего изучения.

Несмотря на подтверждённую стабильность фенотипа ХА штаммов вируса гриппа in vivo, неясно, при каких условиях возможна реверсия фенотипа подобных штаммов и достижимы ли эти условия во время репликации вируса в организме человека.

Получить ответ на эти вопросы чрезвычайно важно прежде всего с точки зрения безопасности применения живой гриппозной вакцины.

Цели и задачи исследования.

Целью работы было изучение молекулярных механизмов холодоадаптации ХА штаммов вируса гриппа А и В и изучение проблемы стабильности фенотипа ХА штаммов на модели ts+ ревертантов ХА штаммов вируса гриппа А и В.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

  1. Получить ХА варианты штаммов вируса гриппа на основе эпидемических штаммов А/Краснодар/101/59 и В/Виктория/2/87 путём пассажей при пониженной температуре и изучить их ts,ca и аттенуированный фенотип, а также мутации, приобретённые за время пассажей при пониженной температуре.

  2. Получить ts+ ревертанты ХА штаммов А/Ленинград/134/47/57, А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/41/87 путём пассажей данных штаммов при постепенно повышающихся температурах и изучить ихts,ca и аттенуированный фенотип.

  3. Оценить эффективность методов комплементационно-рекомбинационного и ПЦР-рестрикционного анализа для контроля стабильности ts мутаций в геноме ХА штаммов и для обнаружения истинных реверсий и супрессорных мутаций на модели ts+ ревертанта ХА штамма А/Ленинград/134/47/57.

  4. Методом секвенирования выявить истинные реверсии tsи caмутаций и супрессорные мутации, возникшие в геномеts+ ревертанта штамма А/Ленинград/134/47/57 и одного из ts+ ревертантов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 в процессе пассажей при повышенной температуре.

Научная новизна работы.

Изучение фенотипа новых ХА штаммов и мутаций в их геноме вносит существенный вклад в понимание механизмов аттенуации вируса гриппа.

Впервые показана возможность получения ts+ ревертантов ХА штаммов вируса гриппа в лабораторных условиях и показана роль как истинных реверсий, так и супрессорных мутаций в реверсии к ts+ фенотипу ХА штаммов вируса гриппа.

Практическая значимость.

Полученные и охарактеризованные в работе ХА штаммы А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 могут быть использованы в дальнейшем для получения живой гриппозной вакцины.

Показано, что для эффективного контроля генетической стабильности и безопасности ХА штаммов-доноров аттенуации вируса гриппа целесообразно комбинированное применение нескольких методов исследования, например, ПЦР-рестрикционного метода и комплементационно-рекомбинационного метода.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Ca, ts и аттенуированный фенотип ХА штаммов может быть обусловлен различным сочетанием caи ts мутаций в разных генах, кодирующих внутренние белки вируса гриппа. Мутации, обуславливающие адаптацию ХА штаммов вирусов гриппа к пониженной температуре, находятся в консервативных участках вирусных белков.

  2. Для реверсии фенотипа ХА штаммов важны как истинные реверсии, так и супрессорные мутации. В соответствии с этим для анализа стабильности генома ХА штаммов и изолятов вакцинных штаммов от вакцинированных людей следует применять методы, позволяющие оценить наличие как истинных реверсий, так и супрессорных мутаций (например, полное секвенирование генома или комбинацию ПЦР-рестрикционного и комплементационно-рекомбинационного анализа).

  3. ХА штаммы вируса гриппа обладают большой степенью фенотипической стабильности. Полная реверсия tsфенотипа этих штаммов возможна при условиях, которые не достижимы во время репликации вируса в организме человека (большое количество пассажей при постепенно повышающихся температурах).

Апробация материалов диссертации и публикации

Материалы диссертации доложены на 13th International Conference on Negative Strand Viruses (Salamanca, Spain, 2006), XIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных “Ломоносов-2006” (Москва, 2006), Third European Congress of Virology (Nuernberg, Germany, 2007), 18th Annual Meeting of the Society for Virology (Heidelberg, Germany, 2008), 14th International Congress of Virology (Istanbul, Turkey, 2008), конференции молодых ученых, посвященной 100-летию получения И.И. Мечниковым Нобелевской премии (Москва, 2008), 19th Annual Meeting of the Society for Virology (Leipzig, Germany, 2009), конференции молодых учёных НИИ ВС им. И.И. Мечникова РАМН (Москва, 2009), международной научной конференции “Противогриппозные вакцины нового поколения” (Санкт-Петербург, 2009).

Апробация диссертации состоялась 22 апреля 2010 г. на научной конференции отдела вирусологии НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН.

По теме диссертации опубликовано 10 научных работ. Получен один патент РФ.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 147 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований с обсуждением полученных данных, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 27 таблицами и 7 рисунками. Библиография включает 147 отечественных и зарубежных источников.

Личный вклад автора заключается в непосредственном участии в выполнении всех разделов данного исследования, а также в проведении анализа полученных данных. Автор признателен к.б.н. И.И. Акоповой за помощь в получении и анализе ts и ca фенотипа ХА штаммов А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87, а также за предоставление данных комплементационно-рекомбинационного анализа ts+ ревертанта А/Ленинград/134/47/57/Rev и Е.Б. Файзулоеву за помощь в секвенировании штаммов А/Краснодар/101/59, А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/41/87.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусы, культуры клеток, куриные эмбрионы. В работе использовали ХА штамм-донор аттенуации для живых гриппозных реассортантных вакцин А/Ленинград/134/47/57 (Н2N2); эпидемические штаммы А/Ленинград/134/57 (H3N2), А/Гонконг/68 (H4N2), А/Краснодар/101/59 (H3N2), В/Виктория/2/87; tsмутанты штамма Вейбридж ВЧП (вируса чумы птиц (H7N7)) и tsмутанты штамма Росток ВЧП.tsмутанты штамма Росток были получены из Национального Института Медицинских Исследований (Лондон, Великобритания). В работе использовали 9-11 дневные куриные эмбрионы (птицекомбинат “Птичное”), а также линию клеток MDCK, полученную из Института Пастера, Франция. Клетки MDCK культивировали по стандартной методике на среде Игла MEM (“ФГУП ПИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН”, Москва) с 5% фетальной сывороткой телят фирмы “HyClone” (США). Для комплементационно-рекомбинационного анализа использовали первичную культуру куриных фибробластов, приготовленную из 9-10-дневных куриных эмбрионов по стандартной методике [Белов Г.А., 2002].

Для определения инфекционного титра вирусов в ЭИД50 и накопления вирусов для последующих опытов куриные эмбрионы заражали по стандартной методике 10-кратными разведениями вируса в аллантоисную полость [Шубладзе А.К. и Гайдамович С.Я., 1954]. Наличие вируса в аллантоисной жидкости определяли по реакции гемагглютинации с 0,5% суспензией эритроцитов кур. Инфекционный титр вируса в ЭИД50/0,2 мл расcчитывали по методу Кербера. Для определения ts и ca фенотипа исследуемых штаммов проводили титрование одновременно при оптимальной, пониженной и повышенной температуре. Разницу в уровне репродукции вируса гриппа при разных температурах выражали величиной RCT (reproductive capacity at different temperatures), которая определяется как разница между инфекционным титром вируса при оптимальной температуре 340С и титром при исследуемой температуре, измеряемым в lgЭИД50/0,2 мл.

Для получения ХА вариантов штаммов вируса гриппа А/Краснодар/101/59 и В/Виктория/2/87,пассажи при пониженной температуре инкубации велись параллельно в куриных эмбрионах и в культуре клеток MDCK. На куриных эмбрионах пассажи проводили в течение 3 суток для вируса гриппа А и в течение 4-6 суток для вируса гриппа В (по 4 суток при температурах 26-300С и 5-6 суток при температуре 250С). На культуре клеток MDCK пассажи проводили в течение 3-7 суток, в зависимости от инфекционной активности вируса. Штамм считали обладающим ts фенотипом в случае, если он был неспособен к репродукции при повышенной температуре (400C для вирусов гриппа А, 380C для вирусов гриппа B), и ca фенотипом в случае, если RCT26 ≤ 3 lgЭИД50/0,2 мл.

Получение ts+ ревертантов ХА штаммов вируса гриппа А (А/Краснодар/101/35/59 и А/Ленинград/134/47/57) и штамма вируса гриппа В В/Виктория/2/41/87 проводилось путем пассажей ХА штаммов в куриных эмбрионах при повышенной температуре. Для следующего пассажа куриные эмбрионы заражали 10-кратными разведениями аллантоисной жидкости из предыдущего пассажа. Инкубация при соответствующей температуре проводилась в течение 48 ч для вируса гриппа А и 72 ч для вируса гриппа В. Схема получения ts+ ревертантов представлена в таблице 1.

Таблица 1.

Схема высокотемпературных пассажей для получения ts+ ревертантов штаммов вируса гриппа А и В.

Для штаммов А/Краснодар/101/35/59 и А/Ленинград/134/47/57

Для штамма В/Виктория/2/41/87

Номера пассажей

Количество пассажей

Температура

Номера пассажей

Количество пассажей

Температура

1-3

3

35

1-3

3

35

4-6

3

36

4-6

3

36

7-10

4

37

7-10

4

37

11-13

3

38

11-16

6

37

14-18

5

40

17-18

2

38

Клонирование ХА штаммов и ts+ ревертантов ХА штамма А/Краснодар/101/35/59 методом бляшек проводили в 6-луночных плашках фирмы “Costar” на 3-дневном монослое клеток MDCK по стандартной методике, используя покрытие из 0,5% агарозы, приготовленное на основе среды Игла МЕМ, содержащей 2мкг/мл трипсина. Через 3 суток клетки заливали 0,5% покрытием из агарозы, содержащим нейтральрот (1,2 мл 0,1% раствора красителя на 25 мл 0,5% агарозного покрытия). Через сутки проводили учёт бляшек в лунках, заражённых разными разведениями вируса. Материал из бляшек накапливали в куриных эмбрионах и, параллельно, в культуре клеток MDCK.

Для определения репродукции вируса в лёгких и носовых ходах мышей [Неведомская Г.Н. и др., 1992], группы cамок беспородных мышей или самок мышей линии Balb/c (по 5-10 штук на группу) заражали интраназально под лёгким эфирным наркозом анализируемыми вирусами в инфекционном титре 107,5 ЭИД50/0,2мл (по 50 мкл на мышь). Инфекционный титр вируса в 10%-ной суспензии лёгких или носовых ходов мышей определяли на куриных эмбрионах и выражали в ЭИД50/0,2мл. Статистическую обработку результатов проводили в программе Excel-2007.

Комплементационно-рекомбинационный анализ с использованием одноударных ts мутантов ВЧП проводился по стандартной методике [Ghenkina D.B. and Ghendon Y.Z., 1979]. Монослойную культуру фибробластов куриного эмбриона (ФКЭ) инфицировали параллельно изучаемыми штаммами вируса гриппа человека и десятикратными разведениями ts мутантов ВЧП, относящихся к различным группам рекомбинации. После 30 мин адсорбции монослой инфицированных клеток заливали агаровым покрытием стандартного состава [Белов Г.А., 2002], и инкубировали при 420С в опытах с ts мутантами штамма Вейбридж и при 400С в опытах с ts мутантами штамма Росток, а в контрольных опытах при 360С в течение 72 часов, после чего учитывали количество образующихся бляшек. В контрольных опытах клетки инфицировали только штаммами вируса гриппа человека или только ts мутантами ВЧП.

Выделение вирусной РНК из аллантоисной жидкости или из вируса, концентрированного центрифугированием, проводили при помощи “Набора для очистки РНК из сыворотки крови” фирмы “Изоген” (Москва) в соответствии с рекомендацией производителя.

Обратную транскрипцию и ПЦР для получения ПЦР-продуктов для последующего секвенирования или рестрикции проводили при помощи системы AccessRT-PCR фирмы “Promega” (в соответствии с рекомендациями производителя). ПЦР-продукты анализировали методом электрофореза в 1,5% агарозном геле, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия, под напряжением 5 В/см.

Анализ стабильности мутаций в геноме ts+ ревертанта ХАштамма А/Ленинград/134/47/57 проводился с использованием ПЦР-рестрикционного метода, разработанного Климовым с соавт. [Klimov A.I. and Cox N.J., 1995; Киселёва и Климов, 2002].

Для секвенирования использовались ПЦР-продукты, очищенные на колонках Wizard (“Promega”, США). Секвенирование проводилось фирмой Евроген на автоматическом секвенаторе MegaBAСE-500. Для анализа нуклеотидных последовательностей, а также для подбора праймеров для ПЦР и секвенирования использовали пакеты программ VectorNTI 9.0 и Omiga 2.0. Синтез праймеров осуществлялся фирмой “Литех” (Москва).

  1. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (57)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится "__ " 2008 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 502.006.17 в Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российская академия государственной
  2. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (35)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится 28 мая 2007 года в 15 часов 15 минут на заседании диссертационного совета Д.210.018.01 в Санкт-Петербургской государственной консерватории имени Н.
  3. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (123)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится 16 сентября 2010 г. в часов минут на заседании Совета Д.212.199.06 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата исторических наук при Российском государственном педагогическом университете им.
  4. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (172)

    Автореферат диссертации
    Диссертация выполнена на кафедре национальных, федеративных и международных отношений Российской академии государственной службы при Президенте Российской Федерации.
  5. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (379)

    Автореферат диссертации
    Защита диссертации состоится " " 2008 г. в аудитории М-611 в час. __ мин. на заседании диссертационного совета Д 212.157.02 при Московском энергетическом институте (Техническом университете) по адресу: ул.
  6. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (459)

    Автореферат диссертации
    Актуальность темы исследования определяется необходимостью глубокого научного анализа причин и характера эмиграции россиян в страны Северной Америки в ХХ веке, в результате которой страна потеряла значительную часть своих наиболее активных сограждан.
  7. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (34)

    Автореферат диссертации
    Актуальность диссертации связана с возросшим интересом исследователей к проблемам социального развития российских регионов. К числу наиболее значимых проблем относится модернизация образования - необходимое условие эффективного общественного развития.
  8. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (157)

    Автореферат диссертации
    Диссертация выполнена в Российской академии государственной службы при Президенте Российской Федерации на кафедре правового обеспечения рыночной экономики
  9. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (200)

    Автореферат диссертации
    Защита диссертации состоится «16» октября 2007г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 022.001.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора филологических наук в Институте языка, литературы и искусства им.
  10. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (277)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится « » 2006 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 002.026.01 при Всероссийском институте научной и технической информации РАН по адресу: 125190, Москва, ул.

Другие похожие документы..