Автореферат диссертации на соискание ученой степени

Таблица 4.

Изменение ts и ca фенотипа штамма В/Виктория/2/87 (В/Вик/дт) в процессе пассажей при пониженной температуре.

Штамм

Титр, lgЭИД50/0,2мл при температурах, 0C, и времени пассирования, сутки

RCT

260C

(6 суток)

340C

(3 суток)

380C

(3 суток)

390C

(3 суток)

RCT26

(6 суток)

RCT38

RCT39

родительский штамм В/Вик/дт

2,8

8,0

5,0

1,5

5,2

3,0

6,5

В/Вик/41

4,5

8,5

1,5

<1

4,0

7,0

>7,5

ХА штамм В/Вик/63

6,0

8,0

<1

-

2,0

>7

-

За время пассажей при пониженной температуре ХА штамм В/Вик/63 приобрёл выраженный tsи caфенотип (Табл. 4) и был аттенуирован для лабораторных животных (не был способен к репродукции в лёгких мышей и обладал сниженными показателями репродукции в носовых ходах мышей, по сравнению со штаммом-предком В/Вик/дт (Табл.3)). Штамм В/Вик/41, прошедший меньшее количество пассажей при пониженной температуре, по своему фенотипу занимал промежуточное положение между ХА штаммом В/Вик/63 и штаммом-предком В/Вик/дт (Табл.3, Табл.4). Этот штамм обладал ts фенотипом, но ca фенотип штамма В/Вик/41 был менее выражен, чем для штамма В/Вик/63 (RCT26(6 суток)= 5,2; 4,0 и 2,0 lgЭИД50/0,2 мл для исходного эпидемического штамма В/Вик/дт, штамма В/Вик/41 и ХА штамма В/Вик/63, соответственно). Кроме того, штамм В/Вик/41 обладал ограниченной способностью к репродукции в лёгких мышей (Табл. 3).

Рисунок 2. Мутации в геноме штаммов В/Вик/41 и В/Вик/63.

Буквой “к” отмечены кодирующие мутации. Синим обведены мутации, отличающие штамм В/Вик/63 от штамма В/Вик/41. Уникальные замены по сравнению со всеми штаммами вируса гриппа B из базы данных GenBank обведены красным. Мутация Val625Ile в гене PA не является полностью уникальной и присутствует у 3% (9 из 317) проанализированных штаммов.

Секвенирование показало (Рис. 2), что за время пассажей при пониженной температуре штамм В/Вик/41 приобрёл 7 мутаций во всех генах, кодирующих внутренние белки (сравнение проводилось с последовательностью нуклеотидов дикого штамма В/Виктория/2/1987 (В/Вик/дт) из базы данных GenBank), причём 5 из них кодировали замену аминокислоты в белках PB2, PB1, NP, M1 и NS1. В гене PA присутствовали только некодирующие мутации. Все 5 аминокислотных замен были уникальными по сравнению со всеми штаммами вируса гриппа В из базы данных GenBank (Рис. 2). Секвенирование кодирующей области всех внутренних генов ХА штамма В/Вик/63 выявило две новых мутации (кодирующая мутация в гене PA и некодирующая мутация в M-гене) по сравнению со штаммом В/Вик/41 (Рис. 2). Расположение обнаруженных в штаммах В/Вик/63 и В/Вик/41 мутаций не коррелировало с расположением уникальных замен в ХА штамме В/ЭннАрбор/1/66 [Hoffmann E. et al., 2005].

Можно сделать вывод о том, что мутация в гене PA – единственная кодирующая мутация, по которой штамм В/Вик/63 отличается от штамма В/Вик/41 – играет большую роль в caиattфенотипе этого штамма. Замена, которая произошла в РА гене штамма В/Вик/63 (Val625Ile) произошла в консервативном участке этого белка: у 97% всех штаммов вируса гриппа В из базы данных GenBank (308 из 317 штаммов) в позиции 625 стоит валин.

Исследование фенотипа штамма В/Вик/63 показывает, что этот штамм (в отличие от штамма В/Вик/41) по своему ts, ca и аттенуированному фенотипу не уступает ранее полученным ХА штаммам вируса гриппа и может быть использован в дальнейшем для производства живой гриппозной вакцины.

Изучение молекулярных механизмов реверсий ХА штаммов к ts+ фенотипу.

ts+ ревертант ХА штамма А/Ленинград/134/47/57.

ts+ ревертант А/Лен/Rev был получен после 18 пассажей ХА штамма А/Ленинград/134/47/57 (А/Лен/47) при постепенно повышающихся температурах (Табл. 1). За время пассажей штамм А/Лен/Rev приобрёл выраженный ts+ фенотип (т.е. репродуцировался при повышенной температуре так же эффективно, как и при оптимальной температуре), утеряв при этом ca фенотип (Табл. 2). При этом штамм А/Лен/Rev, в отличие от исходного ХА штамма-предка А/Лен/47, был способен к репродукции в лёгких мышей (Табл. 3).

ПЦР-рестрикционный анализ мутаций, приобретённых ранее штаммом А/Лен/47 в процессе адаптации к пониженной температуре, выявил наличие единственной истинной реверсии мутации в гене РВ2. Как видно из рисунка 3А, РВ2 ген аллантоисного ревертанта утерял сайт рестрикции Tru91, присутствовавший в штамме А/Лен/47. Все остальные исследованные гены по наличию соответствующих сайтов рестрикции были аналогичны таковым для штамма А/Лен/47 (примеры фотографий агарозного геля см. Рис. 3Б, В).

Рисунок 3. Исследование сохранности уникальных мутаций в геноме ts+ ревертанта А/Лен/Rev методом ПЦР-рестрикционного анализа.

L – ХА штамм А/Лен/47; R – ревертант А/Лен/Rev; HK – эпидемический штамм А/Гонконг/68 (H3N2). Сбоку отмечен размер соответствующих продуктов рестрикции (для гена PB2 исходный ПЦР-продукт имел размер 240, а продукты рестрикции – размеры 155 и 85 нуклеотидов, для гена PB1 – 304=227+77, для гена NP – 314=287+27). Красным обведена истинная реверсия мутации в гене PB2 (исчезновение сайта рестрикции, присутствовавшего в геноме ХА штамма). Для остальных генов результаты рестрикционного анализа ревертанта соответствовали таковым для ХА штамма.

Тем не менее, опыты по рекомбинации исследуемого вируса с одноударными tsмутантами ВЧП, содержащими ts мутацию в известном гене (комплементационно-рекомбинационный анализ) показали реверсию фенотипического проявления мутации в трёх генах (PB2, NP и NS). Как видно из Табл. 5, штамм А/Лен/Rev, в отличие от исходного ХА штамма, «спасал» ts фенотип мутантов ВЧП, имеющих ts мутации в генах, кодирующих белки PB2, NP и NS, что говорит о наличии фенотипической реверсии проявления ts мутаций, локализованных в соответствующих РНК-сегментах генома ts+ ревертанта. Реверсия ts фенотипа гена РВ2 могла быть связана с прямой реверсией мутации, обнаруженной ПЦР-рестрикционным методом, однако в случае генов, кодирующих белки NP и NS, прямой реверсии не наблюдалось. Было выдвинуто предположение, что в этом случае комплементация с соответствующими мутантами ВЧП обусловлена экстра- или интрагенными супрессорными мутациями.

Таблица 5.

Рекомбинация ts+ ревертанта А/Лен/Rev, исходного ХА штамма А/Ленинград/134/47/57 (А/Лен/47) и дикого штамма А/Краснодар/101/59 (А/Кр/дт) c ts мутантами ВЧП.

Ts мутант

Мутант-ный белок

Образование бляшек в культуре ФКЭ инфицированной совместно исследуемым вирусом и ts мутантами ВЧП при указанных температурах (в БОЕ/мл)

Образование бляшек tsмутантами ВЧП при указанных температурах (контроль)

А/Лен/47

А/Лен/Rev

А/Кр/дт

36°C

40/42°C

36°C

40/42°C

36°C

40/42°C

36°C

40/42°C

ts 29

PB2

3·107

<102

1·106

2·104

1·107

3·106

2·107

<102

15/1

PB1

2·105

<102

2·106

<102

4·105

1·104

1·105

<102

ts166

PA

5·106

1·105

2·107

1·105

3·106

1·105

3·106

<102

US1

NP

1·106

<102

1·106

2·104

2·106

3·105

1·106

<102

ts303/1

M1/M2

6·105

102

3·105

<102

6·105

6·103

5·105

<102

MN3

NS1/NS2

1·106

<102

2·106

5·104

8·105

3·104

2·106

<102

Обозначения: Красным отмечены гены, в которых произошла реверсия ts мутации.

Секвенирование кодирующей части “внутренних” генов ts+ ревертанта А/Лен/Rev (A/Leningrad/134/47/ts+18/1957(H3N2), GenBank, EF633437 - EF633442) выявило возникновение в процессе адаптации к повышенной температуре 27 новых мутаций во всех “внутренних” генах, из которых 13 кодируют замену аминокислот во всех внутренних белках, кроме M2 и NS2 (сравнение проводилось с последовательностью штамма А/Лен/47 из базы данных GenBank (А/Ленинград/134/47/57, M81582 – M81587)) (Рис. 4).

Секвенирование подтвердило сохранность всех мутаций, приобретённых ранее штаммом А/Лен/47 в процессе холодовой адаптации, кроме двух мутаций – в гене РВ2 (478ValLeuVal) и в гене РВ1 (265LysAsnLys) (Рис. 4), причём реверсия tsмутации в гене РВ1, в отличие от реверсии в гене РВ2, не была обнаружена методом ПЦР-рестрикционного анализа. Последнее связано с тем, что на нуклеотидном уровне истинной реверсии не произошло (819GТA), в результате чего не произошло восстановление сайта рестрикции рестриктазы HindIII.

Реверсии мутаций в генах PB1 и PB2, или некоторые из дополнительных мутаций в геноме штамма А/Лен/Rev, в соответствии с результатами комплементационно-рекомбинационного теста, супрессировали фенотипическое проявление ts мутаций в генах NP и NS ts+ ревертанта. Полученные данные не позволяют судить о том, какие именно мутации обусловили супрессию.

Рисунок 4. Мутации во внутренних генах ts+ ревертанта А/Лен/Rev. Буквой “к” отмечены кодирующие мутации. Зелёным отмечены мутации, приобретённые ХА штаммом в процессе пассажей при пониженной температуре и сохранившиеся в геноме ts+ ревертанта. Жёлтым отмечены новые мутации, приобретённые ts+ ревертантом. Красным отмечены истинные реверсии мутаций. На рисунке текстом обозначены только кодирующие мутации в геноме ts+ ревертанта.

Полученные данные об истинных реверсиях в геноме штамма А/Лен/Rev свидетельствуют в пользу того, что реверсия в большой мере произошла благодаря мутациям в генах, кодирующих белки РВ2 и РВ1, что соответствует данным литературы о роли этих генов в проявлении tsфенотипа различными штаммами вируса гриппа [Hoffmann E. et al., 2005; Jin H. et al., 2003; Jin H. et al., 2004; Kiseleva I. et al., 2010; Klimov A.I. et al., 2001]. Тем не менее, нельзя исключить роль дополнительных мутаций в реверсии фенотипа штамма А/Лен/47 в процессе пассажей при высокой температуре, за счёт явлений экстра- и интрагенной супрессии tsмутаций в генах NP и NS. По имеющимся данным нельзя судить об экстра- или интрагенной природе мутаций, супрессирующих фенотип гена NP. Мутация в гене NS2 достоверно была супрессирована экстрагенно, поскольку новых мутаций в участке гена, кодирующем белок NS2, обнаружено не было, однако невозможно сказать о том, какой ген является супрессором в данном случае.

ts+ ревертанты ХА штамма А/Краснодар/101/35/59.

ts+ ревертанты штамма А/Кр/35 (А/Кр/Rev1 и А/Кр/Rev2) были получены по той же схеме, что и ts+ ревертант штамма А/Лен/47 (Табл. 1). За время пассажей при повышенной температуре ревертанты штамма А/Кр/35, так же, как и ревертант штамма А/Лен/47, приобрели ts+ фенотип (RCT40=1 lgЭИД50/0,2 мл), но при этом были способны к ограниченной репродукции при пониженной температуре (RCT26(6 суток)=3,2-5 lgЭИД50/0,2 мл) (Табл. 2).

Штамм А/Кр/Rev1, подобно штамму А/Лен/Rev, в процессе пассажей при повышенной температуре утерял аттенуированный фенотип, в то время как ревертант А/Кр/Rev2 по своей способности к репродукции в лёгких и носовых ходах мышей был близок к исходному ХА штамму А/Кр/35 (Табл. 3). Надо отметить, что трёхкратное клонирование методом бляшек практически не повлияло на фенотип ревертантов штамма А/Кр/35 (Табл. 2, Табл. 3).

В целом изучение ts+ ревертантов ХА штаммов А/Лен/47 и А/Кр/35 показало, что реверсия к ts+ фенотипу может сопровождаться разной степенью выраженности са фенотипа и не всегда приводит к потере аттенуированного фенотипа на модели мышей. Из этого следует, что за са, ts и аттенуированный фенотип ХА штамма А/Кр/35 отвечают разные мутации в его геноме. Судя по данным литературы, это общая закономерность для ХА штаммов вируса гриппа [Киселёва И.В. и др., 2003; Ларионова Н.В. и др., 2006; Panzig B. et al., 1984; Zhang Y.M. et al., 1982].

Секвенирование всех внутренних генов ts+ ревертанта А/Кр/Rev2 показало, что реверсия штамма А/Кр/Rev2 произошла за счёт 2-х истинных реверсий (в генах, кодирующих белки M2 (42IleValIle) и NP (369GluValGlu)) и 15 дополнительных мутаций во всех внутренних генах, кроме гена PA (из них 9 – кодирующих замену аминокислоты) (Рис. 5).

Рисунок 5. Мутации во внутренних генах ts+ ревертанта А/Кр/Rev2. Буквой “к” отмечены кодирующие мутации. Зелёным отмечены мутации, приобретённые ХА штаммом в процессе пассажей при пониженной температуре и сохранившиеся в геноме ts+ ревертанта. Жёлтым отмечены новые мутации, приобретённые ts+ ревертантом. Красным отмечены истинные реверсии мутаций. На рисунке текстом обозначены только кодирующие мутации в геноме ts+ ревертанта.

Можно заключить, что истинных реверсии мутаций в М2 и NP генах, даже при наличие ряда дополнительных мутаций, недостаточно для потери ХА штаммом аттенуированногофенотипа для мышей.

Новая мутация в гене, кодирующем белок М1 (Arg101Lys), лежит в участке 101-105 этого белка. В этом же участке возникла мутация в ХА штамме А/Кр/35 (Leu103Ile), сохранившаяся в процессе пассажей при повышенной температуре в геноме штамма А/Кр/Rev2. Не исключено, что мутация Arg101Lys супрессировала действие мутации Leu103Ile.

Наши результаты говорят о большой стабильности ряда маркёров аттенуированного фенотипа ХА штаммов вируса гриппа A: во-первых, для реверсии ts+ фенотипа данных штаммов потребовалось большое количество пассажей (около 18-ти) при постепенно повышающихся температурах; во-вторых, даже реверсия tsфенотипа не всегда сопровождалась полной реверсией са и att фенотипа.

ts+ ревертант штамма В/Виктория/2/41/87.

Полученный после 18 пассажей при повышенной температуре ts+ ревертант В/Вик/Rev (Табл.1) не только утерял ts фенотип, присущий штамму В/Вик/41, но обладал более выраженным ts+ фенотипом по сравнению со своим диким штаммом-предком (RCT38=7,0; 3,0 и <1 lgЭИД50/0,2 мл, для штаммов В/Вик/41, В/Вик/дт и В/Вик/Rev, соответственно) (Табл. 6). При этом, изменения способности к репродукции при пониженной температуре не произошло (RCT26(6)=3,5-4,5 lgЭИД50/0,2 мл для ревертантов и 4 lgЭИД50/0,2 мл для ХА штамма).

Таблица 6.

Изменение ts и ca фенотипа ХА штамма В/Виктория/2/41/87 (В/Вик/41) в процессе пассажей при повышенной температуре.

Штамм

Титр, lgЭИД50/0,2мл при температурах, 0C, и времени пассирования, сутки

RCT

260C

(6 суток)

340C

(3 суток)

380C

(3 суток)

390C

(3 суток)

RCT26(6 суток)

RCT38

RCT39

В/Вик/дт

2,8

8,0

5,0

1,5

5,2

3,0

6,5

В/Вик/41

4,5

8,5

1,5

0

4,0

7,0

8,5

В/Вик/Rev

4,5

7,5

7,5

1,5

3,0

0

6,0

Итак, результаты исследования реверсии к ts+ фенотипу штамма В/Вик/41 так же, как и в случае ревертантов вирусов гриппа А, говорят о большой степени стабильности фенотипа ХА штаммов вируса гриппа и о том, что ts+ фенотип не всегда сочетается с неспособностью к репродукции при пониженной температуре. Изучение полученных в работе ревертантов показывает, что за са и за ts фенотип ХА штаммов отвечают разные мутации, что совпадает с данными по исследованию других ХА штаммов вируса гриппа [Chen Z. et al., 2006; Hoffmann E. et al., 2005].

Выводы:

  1. ХА штаммы вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 обладают ca, ts и att фенотипом и могут быть предложены в качестве кандидатов штаммов-доноров для производства живых гриппозных вакцин.

  2. Большая часть мутаций, ответственных за ts и ca фенотип, в ХА штаммах вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 расположены в консервативных участках белков.

  3. Не наблюдается корреляции в расположении уникальных замен в геноме ХА штаммов вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59 и В/Виктория/2/63/87 и в геноме ХА штаммов, полученных другими исследователями.

  4. Для адаптации штамма вируса гриппа В/Виктория/2/87 к пониженной температуре потребовалось в два раза больше пассажей по сравнению со штаммом А/Краснодар/101/59, однако темпы реверсии вирусов гриппа А и В к ts+ фенотипу оказались сравнимыми.

  5. ХА штаммы вируса гриппа А и В обладают высокой стабильностью са и ts фенотипа.

  6. Реверсия tsфенотипа ХА штаммов вируса гриппа А и В не всегда сопровождается реверсией са фенотипа и утерей аттенуированного фенотипа.

  7. Реверсии ts фенотипа ХА штаммов вируса гриппа обусловлены появлением как истинных реверсий, так и интра- или экстрагенных супрессорных мутаций в отдельных генах.

  8. Реверсия tsмутации в NS гене ts+ ревертанта штамма А/Ленинград/134/47/57 обусловлена явлением экстрагенной супрессии, а реверсияtsмутации в NP гене – экстра- или интрагенной супрессией.

  9. Реверсия ts фенотипа ХА штаммов обусловлена как истинными реверсиями, так и супрессорными мутациями. В соответствии с этим для анализа стабильности генома ХА штаммов и изолятов вакцинных штаммов от вакцинированных людей следует применять методы, позволяющие оценить наличие как истинных реверсий, так и супрессорных мутаций (например, полное секвенирование генома или комбинацию ПЦР-рестрикционного и комплементационно-рекомбинационного анализа).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Маркушин С.Г. Молекулярные механизмы реверсий к ts+ фенотипу холодоадаптированных штаммов вируса гриппа А - доноров для живых гриппозных вакцин. / Акопова И.И., Коптяева И.Б., Цфасман Т.М. и Гендон Ю.З. // Вопросы вирусологии. – 2006. – Т. 51. №5. – С. 17-22.

  2. Цфасман Т.М. Молекулярные механизмы реверсий к ts+-фенотипу и их зависимость от способов пассирования холодоадаптированного штамма вируса гриппа А – донора аттенуации для производства живых гриппозных вакцин. / Маркушин С.Г., Акопова И.И. и Коптяева И.Б. // Актуальные вопросы эпидемиологии инфекционных болезней (сборник научных трудов). Российская академия последипломного образования, каф. эпидемиологии. – 2006. – Вып.8 – С. 513-515.

  3. Tsfasman T. Molecular mechanisms of reversion to the ts+ (non-temperature-sensitive) phenotype of influenza A cold-adapted (ca) virus strains. / Markushin S., Akopova I. and Ghendon Y. // Journal of General Virology. – 2007 – Vol. 88 – P. 2724-2729.

  4. Гендон Ю.З. Холодоадаптированный штамм вируса гриппа А/H3N2 Краснодар/101/59/35, предназначенный в качестве штамма-донора аттенуации для получения реассортантных холодоадаптированных вакцинных штаммов для живой гриппозной вакцины / Маркушин С. Г., Акопова И. И., Коптяева И. Б. и Цфасман Т.М. // Патент РФ № 2354695.

  5. Markushin S. Molecular mechanisms of reversion to the ts+ phenotype of cold-adapted influenza A strains - attenuation donors for the influenza reassortant live attenuated vaccines. / Akopova I., Koptiaeva I., Tsfasman T. and Ghendon Y. // Salamanca, Spain, June 17-22, 2006 Abstracts of 13-th international conference on negative strand viruses – 2006. – P. 214.

  6. Цфасман Т.М. Молекулярные механизмы реверсий к ts+ фенотипу холодоадаптированных штаммов вируса гриппа А - доноров для живых гриппозных вакцин. / Маркушин С.Г., Акопова И.И., Коптяева И.Б. и Гендон Ю.З. // Москва. 12-15 апреля 2006г. Тезисы XIII международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных “Ломоносов-2006” – 2006. – C. 242-243.

  7. Tsfasman T. Molecular mechanisms of reversion to the ts+ phenotype of influenza A cold-adapted virus strains. / Markushin S., Akopova I. and Ghendon Y. // Nuernberg, Germany, September 1-5, 2007. Third European Congress of Virology Programme and Abstracts – 2007 – P.83.

  8. Tsfasman T. Reversion to the ts+ phenotype of influenza A cold-adapted strains associated with the loss of attenuated phenotype in mice. / Markushin S., Akopova I., Kopriaeva I. and Ghendon Y. // Heidelberg, Germany, March 5-8, 2008. 18th Annual Meeting of the Society for Virology, , Programme and Abstracts – 2008. – P. 276.

  9. Akopova I. Novel cold-adapted influenza virus strain A/Krasnodar/101/35/59(H3N2) for live influenza vaccine production. / Tsfasman T., Markushin S., Ghendon Y. and Faizuloev E. // Istanbul, Turkey, August 10-15, 2008. IUMS Congress: 14th International Congress of Virology – 2008. – P. 159.

  10. Tsfasman T. Reversion to the ts+ phenotype of influenza A cold-adapted strains is not always associated with the loss of attenuated phenotype in mouse lung. / Markushin S. and Ghendon Y. // Leipzig, Germany, March 18–21, 2009. 19th Annual Meeting of the Society for Virology – 2009. – P. 176.

  11. Цфасман Т.М. Механизмы реверсий холодоадаптированных вакцинных штаммов вируса гриппа А к ts+ фенотипу на примере ts+ ревертантов штаммов А/Ленинград/134/47/57 и А/Краснодар/101/59/35. / Маркушин С.Г., Акопова И.И., Коптяева И.Б. и Гендон Ю.З. // Санкт-Петербург. 28-29 октября 2009. Сборник статей и тезисов международной научной конференции “Противогриппозные вакцины нового поколения” – 2009. – C. 82-83.

  1. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (57)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится "__ " 2008 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 502.006.17 в Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российская академия государственной
  2. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (35)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится 28 мая 2007 года в 15 часов 15 минут на заседании диссертационного совета Д.210.018.01 в Санкт-Петербургской государственной консерватории имени Н.
  3. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (123)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится 16 сентября 2010 г. в часов минут на заседании Совета Д.212.199.06 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата исторических наук при Российском государственном педагогическом университете им.
  4. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (172)

    Автореферат диссертации
    Диссертация выполнена на кафедре национальных, федеративных и международных отношений Российской академии государственной службы при Президенте Российской Федерации.
  5. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (379)

    Автореферат диссертации
    Защита диссертации состоится " " 2008 г. в аудитории М-611 в час. __ мин. на заседании диссертационного совета Д 212.157.02 при Московском энергетическом институте (Техническом университете) по адресу: ул.
  6. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (459)

    Автореферат диссертации
    Актуальность темы исследования определяется необходимостью глубокого научного анализа причин и характера эмиграции россиян в страны Северной Америки в ХХ веке, в результате которой страна потеряла значительную часть своих наиболее активных сограждан.
  7. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (34)

    Автореферат диссертации
    Актуальность диссертации связана с возросшим интересом исследователей к проблемам социального развития российских регионов. К числу наиболее значимых проблем относится модернизация образования - необходимое условие эффективного общественного развития.
  8. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (157)

    Автореферат диссертации
    Диссертация выполнена в Российской академии государственной службы при Президенте Российской Федерации на кафедре правового обеспечения рыночной экономики
  9. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (200)

    Автореферат диссертации
    Защита диссертации состоится «16» октября 2007г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 022.001.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора филологических наук в Институте языка, литературы и искусства им.
  10. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (277)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится « » 2006 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 002.026.01 при Всероссийском институте научной и технической информации РАН по адресу: 125190, Москва, ул.

Другие похожие документы..