Автореферат диссертации на соискание ученой степени

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение молекулярных механизмов адаптации к пониженной температуре вирусов гриппа А и В на модели ХА мутантов штаммов А/Краснодар/101/59 и В/Виктория/2/87.

ХА штамм А/Краснодар/101/35/59(H2N2).

ХА штамм А/Краснодар/101/35/59(H3N2) (А/Кр/35) прошёл 5 пассажей при 300С и 25 пассажей при 260С на куриных эмбрионах, а затем 5 пассажей при 260С на культуре клеток MDCK (общее число пассажей – 35), после чего, с целью получения генетически однородного штамма, вирус был трижды клонирован методом бляшек в культуре клеток MDCK.

ХА штамм А/Кр/35, в отличие от соответствующего дикого штамма-предка А/Краснодар/101/59 (А/Кр/дт), обладал выраженным ts и ca фенотипом (Табл. 2), т.е. не был способен к репродукции при температуре 400С и эффективно репродуцировался при температуре 260С.

Таблица 2.

Сравнение способности ts+ ревертантов ХА штаммов, ХА штаммов и диких штаммов-предков к репродукции при повышенной и пониженной температуре.

Штамм

Титр, lgЭИД50/0,2 мл при температурах, 0С, и времени пассирования

RCT

260С

(3 суток)

260С

(6 суток)

340С

(48 ч)

400С

(48 ч)

RCT26(3 cуток)

RCT26(6 суток)

RCT40

А/Кр/дт

2,0

4,2

9,0

8,0

7,0

4,8

1,0

А/Кр/35

4,0

6,8

10,0

0

6,0

3,2

10,0

А/Кр/Rev1, неклонированный

3,5

4,2

9,5

8,5

6,0

5,3

1,0

А/Кр/Rev1

2,2

4,0

9,0

8,0

6,8

5,0

1,0

А/Кр/Rev2, неклонированный

3,5

5,0

9,0

8,0

5,5

4,0

1,0

А/Кр/Rev2

3,5

5,5

9,0

8,0

5,5

3,5

1,0

А/Лен/дт

2,5

3,5

8,0

6,8

5,5

4,5

1,2

А/Лен/47

4,0

7,0

9,5

1,0

5,5

2,5

8,5

А/Лен/Rev

2,5

3,0

8,5

8,0

6,0

5,5

0,5

Кроме того, штамм А/Кр/35, в отличие от штамма-предка А/Кр/дт, практически не был способен к репродукции в лёгких мышей (Табл.3), что свидетельствует о снижении патогенности этого штамма.

Секвенирование кодирующих участков всех внутренних генов ХА штамма и его дикого штамма-предка показало, что за время адаптации к пониженной температуре штамм А/Кр/35 приобрёл 13 нуклеотидных замен во всех внутренних генах, кроме гена, кодирующего белки NS1 и NS2, из которых 8 привели к изменению аминокислот в белках РВ2, РВ1, РА, NP, M1 и M2 (Рис. 1).

Таблица 3.

Сравнение способности ХА штаммов, их ts+ ревертантов и диких штаммов-предков к репродукции в органах мышей.

Штамм

Средний титр вируса в органах мышей на 3 день после инфицирования,

lgЭИД50/0,2 мл

(доверительный интервал, α=0,05)

В носовых ходах

В лёгких

А/Кр/дт

1,3±0,4

3,65±0,4

А/Кр/35

0±0

0,4±0,4

А/Кр/Rev1, неклонированный

2,8±0,3

1,6±1

А/Кр/Rev1

1,5±0,5

2,5±1,2

А/Кр/Rev2, неклонированный

1,2±0,3

0,4±0,6

А/Кр/Rev2

0,8±0,5

0,3±0,5

А/Лен/дт*

-

2,0

А/Лен/47*

-

<1,0

А/Лен/Rev*

-

3,0

В/Вик/дт*

3,9±0,4

3,9±0,3

В/Вик/41*

2,5±0,4

1,8±0,7

В/Вик/63*

2±0,6

0,4±0,4

*Для опытов по репродукции штаммов А/Лен/47, А/Лен/дт, А/Лен/Rev,В/Вик/дт, В/Вик/41, В/Вик/63 в органах мышей использовали самок мышей линии Balb/c. Остальные опыты проводились на самках беспородных мышей. Для одних и тех же штаммов различия в репродукции в органах беспородных мышей и мышей линии Balb/c были незначительными.

При этом все предсказанные по нуклеотидной последовательности штамма А/Кр/35 аминокислотные замены уникальны для данного штамма среди всех последовательностей нуклеотидов всех штаммов вируса гриппа А человека (H3N2, H4N2 и H2N1), представленных в базе данных GenBank. Все мутации на уровне аминокислот произошли в консервативных участках соответствующих белков: штаммы вируса гриппа H3N2, а также штаммы H4N2 и H2N1, с которыми проводилось сравнение, имеют в соответствующих позициях одну и ту же аминокислоту. При этом расположение нуклеотидных замен в геноме штаммаА/Кр/35 отличается от такового для других отсеквенированных к настоящему времени ХА штаммов (А/Ленинград/134/17/57, А/Ленинград/47/57 и А/ЭннАрбор/6/60).

Следует отметить, что мутация в гене М1 штаммаА/Кр/35, обуславливающая замену аминокислоты Leu103Ile, лежит в области 101-RKLKR-105, которая в том числе отвечает за связывание белка М1 с РНК. Интересно, что одновременная замена Arg101Ser и Arg105Ser в этой области обуславливает приобретениеts фенотипа штаммом А/WSN/33 [Liu T. and Ye Z., 2004; Liu T. and Ye Z., 2005]. Можно предположить важную роль мутации Leu103Ile в М1-белке для поддержанияts фенотипа штамма А/Кр/35.

Рисунок 1. Мутации в геноме ХА штамма А/Кр/35.

Буквой “к” отмечены кодирующие мутации. Уникальные замены по сравнению со штаммами вируса гриппа А человека из базы данных GenBank обведены красным.

По итогам экспериментов нами был получен ХА штамм вируса гриппа А/Краснодар/101/35/59, по своемуts, са и att фенотипу не уступающий ранее полученным ХА штаммам вируса гриппа – донорам для производства живой гриппозной вакцины и обладающий рядом уникальных мутаций во внутренних генах. Фенотипические характеристики данного штамма говорят о перспективности дальнейших исследований, касающихся его применения для производства живой вакцины против гриппа.

ХА варианты штамма В/Виктория/2/87.

На основе эпидемического штамма В/Виктория/2/87 (В/Вик/дт) методом пассирования при пониженной температуре нами было получено два штамма. Первый из них (В/Виктория/2/41/87 (В/Вик/41)) прошёл 6 пассажей при температуре 300С и 5 пассажей при 260С на куриных эмбрионах, а затем 30 пассажей в культуре клеток MDCK при 24-260С, после чего был трижды клонирован методом бляшек в культуре клеток MDCK. Второй штамм (В/Виктория/2/63/87 (В/Вик/63)), прошёл дополнительно 4 пассажа при 24-260С на клетках MDCK и 18 пассажей при 24-260С на куриных эмбрионах и был клонирован трижды методом бляшек для получения генетически однородного штамма.

  1. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (57)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится "__ " 2008 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 502.006.17 в Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российская академия государственной
  2. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (35)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится 28 мая 2007 года в 15 часов 15 минут на заседании диссертационного совета Д.210.018.01 в Санкт-Петербургской государственной консерватории имени Н.
  3. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (123)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится 16 сентября 2010 г. в часов минут на заседании Совета Д.212.199.06 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата исторических наук при Российском государственном педагогическом университете им.
  4. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (172)

    Автореферат диссертации
    Диссертация выполнена на кафедре национальных, федеративных и международных отношений Российской академии государственной службы при Президенте Российской Федерации.
  5. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (379)

    Автореферат диссертации
    Защита диссертации состоится " " 2008 г. в аудитории М-611 в час. __ мин. на заседании диссертационного совета Д 212.157.02 при Московском энергетическом институте (Техническом университете) по адресу: ул.
  6. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (459)

    Автореферат диссертации
    Актуальность темы исследования определяется необходимостью глубокого научного анализа причин и характера эмиграции россиян в страны Северной Америки в ХХ веке, в результате которой страна потеряла значительную часть своих наиболее активных сограждан.
  7. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (34)

    Автореферат диссертации
    Актуальность диссертации связана с возросшим интересом исследователей к проблемам социального развития российских регионов. К числу наиболее значимых проблем относится модернизация образования - необходимое условие эффективного общественного развития.
  8. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (157)

    Автореферат диссертации
    Диссертация выполнена в Российской академии государственной службы при Президенте Российской Федерации на кафедре правового обеспечения рыночной экономики
  9. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (200)

    Автореферат диссертации
    Защита диссертации состоится «16» октября 2007г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 022.001.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора филологических наук в Институте языка, литературы и искусства им.
  10. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (277)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится « » 2006 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 002.026.01 при Всероссийском институте научной и технической информации РАН по адресу: 125190, Москва, ул.

Другие похожие документы..