Автореферат диссертации на соискание ученой степени

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулирована цель и основные задачи работы, охарактеризована научная новизна полученных результатов.

Первая глава содержит обзор литературы по теме данного исследования. В нем охарактеризована роль углекислоты в жизнедеятельности. Описаны процессы генерации АФК, карбонатных радикалов и пероксимонокарбоната в растворах бикарбонатов. Свойства структурированных вод и их роль в свободно-радикальных процессах, протекающих в водных системах. Рассмотрены свойства фуллеренов и их гидратированных форм как биологически активных агентов.

Вторая глава посвящена описанию оборудования, реактивов и методики экспериментов. В Разделе 2.1. описаны источники использованных реактивов, их характеристики, способы приготовления запасных и рабочих растворов реагентов. Для приготовления водных растворов использовали дистиллированную деионизированную воду, очищенную на приборе ELSICO-HPLC, электропроводность воды составляла 0,8 мкСм/см. Все реагенты были категории не ниже ЧДА (Reagent grade). Концентрации Н2О2 и люминола в запасных растворах уточняли спектрометрически перед их использованием. Различные буферные растворы готовили в соответствии с рекомендациями «Справочника биохимика» (М.: Мир, 1991). В экспериментах, в которых исследовали влияние на ХЛ гидратированных фуллеренов (HyFn), использовали препарат гидратированных фуллеренов С60 с концентрацией 1мМ в 5мМ NaHCO3, любезно предоставленный Г. В. Андриевским. Из исходных растворов HyFn делали серийные десятичные и сотенные разведения HyFn и вносили в 1 мл готовых бикарбонатных растворов по 10 мкл разведений до концентраций 10-9 – 10-20 М.

В Разделе 2.2. описаны методики измерения ХЛ и спектров ЭПР. Спектры ЭПР регистрировали радиоспектрометром ЭПР РЭ-1307 3-х-сантиметрового диапазона (ЭЗАН, г. Черноголовка). Условия регистрации спектров: мощность СВЧ-излучения 4 мВт, амплитуда ВЧ модуляции 0,1 Гаусс. Измерения проводили при комнатной температуре 20-22оС в плоской кварцевой кювете (внутренний зазор 0,25 мм), куда помещали 35 мкл образца. В случае освещения образца использовали светодиод марки «LXHP-PRO 2» фирмы «Luxeоn LEDs» с длиной волны 455 нм с мощностью 5 Вт при 6,84 В. В качестве спиновой ловушки ЭПР был взят тайрон (4,5-дигидроксибензол-1,3-дисульфокислоты), концентрация которого в образцах составляла 10 мМ.

ХЛ-излучение регистрировали работающими в режиме счета одиночных фотонов люминометрами - «Биотокс 7А», «Биотокс 7», «Биотокс-7С» (АНО «Инженерный центр-экология», Россия). «Биотокс 7» оснащен фотоумножителем ФЭУ-101 с диаметром фотокатода 1 см (темновой ток ~ 10 имп./сек) и имеет термостатируемую камеру для образца; «Биотокс 7А» – фотоумножителем 9750QB/1 (EMI Electronics) с диаметром фотокатода 5 см (темновой ток ~ 25 имп./сек). Область спектральной чувствительности обоих ФЭУ составляет 380-710 нм, а максимальная чувствительность лежит в области 450 нм; «Биотокс-7С» снабжен малошумящими ФЭУ-142 и ФЭУ-101, оба с диаметром фотокатодов 1 см (Россия) (темновой ток ~ 5 имп./сек) с областью спектральной чувствительности ФЭУ 300-600 нм, областью максимальной спектральной чувствительности 380-490 нм. ФЭУ в счетчиках расположены горизонтально и регистрируют излучение с боковой поверхности сосуда, помещенного в камеру для образца. Интенсивность излучения измеряли с дискретой 1 сек (имп./сек). Измерение излучения в большинстве случаев проводили из растворов объемом 1 мл, помещенных в пробирки «Эппендорф». В отдельных экспериментах использовали флаконы для сцинтилляционного счета или кварцевые и стеклянные кюветы. В экспериментах по измерению влияния температуры на ХЛ раствора кварцевую кювету с растворами помещали в медный блок, через полую стенку которого пропускали воду от водяных термостатов, один из которых подавал в блок горячую, другой – холодную воду. Система подачи воды включала краны для переключения подачи воды от термостатов, что позволяло повышать и понижать температуру растворов в кювете. В кювету помещали миниатюрный германиевый датчик температуры, сигнал от которого после преобразования АЦП поступал на компьютер, что позволяло одновременно регистрировать температуру раствора и ХЛ из него. Значения рН растворов измеряли на pH метре-иономере «ЭКСПЕРТ-001» (Эконикс-Эксперт – Россия). Все результаты поступали на компьютер в ASCII-кодах через собственные программы приборов. Полученные файлы переводили в графическую форму с использованием программ Statistica 8 и Microsoft Excel. В этих же программах статистически обрабатывались полученные результаты и строились графики.

В Третьей главе приводятся результаты исследования и их обсуждение.

В Разделе 3.1. описаны эксперименты по выявлению О2●/НО2● в растворе бикарбонатов с помощью метода ЭПР. Как видно из рисунка 1, в темноте сигнал спиновой ловушки тайрона ЭПР регистрируется из раствора с 10 мМ, но не с 5 мМ NaHCO3. При освещении раствора с 5 мМ NaHCO3 уровень супероксидного радикала в нем становится достаточным для уверенной регистрации сигнала ЭПР. Следует отметить, что амплитуда сигнала ЭПР из 10 мМ раствора NaHCO3 возрастала при освещении в 3,6 раза, по сравнению с его уровнем в темноте. (рис. 1).

А.

Б.

Рисунок 1. Спектры ЭПР спиновой ловушки тайрона в темноте (А) и при освещении синим светом 455 нМ ( Б ) в растворах NaHCO3 (5 и 10 мМ).

Амплитуда спектров ЭПР тайрона зависит от рН (рис. 2). Как на свету, так и в темноте максимальная амплитуда характерна для раствора с рН 9,0. В воде с рН, доведенным 0,1N NaOH до 8,94, сигнал не наблюдался. Сигнал также не наблюдался в растворах Н2О2 (3 мМ) и в боратных буферах при значениях рН в диапазоне 8,5-9,4. Это свидетельствовало о необходимости ионов HCO3/CO32─ для продукции супероксидных радикалов в растворе и о существовании оптимума рН для их продукции.

При одинаковом значении рН 8,9 амплитуды сигнала ЭПР тайрона возрастают с ростом концентрации HCO3/CO32─ (рис. 3). Интересно отметить, что при оптимальном значении рН и при освещении, достаточный для регистрации сигнала ЭПР уровень супероксидного радикала имеется даже в 1мМ растворе бикарбоната.

А.

Б.

Рисунок 2. Зависимость амплитуды спектров ЭПР тайрона в растворе NaHCO3
(10 мМ) от рН в темноте (А) и при освещении синим светом 455 нМ (Б). рН 8,52 (линия 1); рН 8,72 (2); рН 9,01 (3); рН 9,15 ( 4); вода с рН 8,94 (5),

Рисунок 3. Амплитуды спектров ЭПР тайрона в растворах NaHCO3 (1; 5; 25; 100 мМ) со значением рН 8,9 при освещении светом 455 нМ.

Как видно на рис. 4, при добавлении в раствор NaHCO3 перекиси водорода
(3 мМ) амплитуда сигнала ЭПР спиновой ловушки тайрона при освещении раствора бикарбоната NaHCO3 (5 мМ) уменьшается на 45% по сравнению с контролем. При добавлении FeSO4 (10 мкМ) сигнал уменьшается лишь на 20%, а при одновременном добавлении Н2О2 и Fe(II), сигнал ингибируется на ~75%.

Рисунок 4. Спектры ЭПР спиновой ловушки тайрона при освещении синим светом 455 нМ в растворе NaHCO3 (5 мМ) (линия 1), с перекисью водорода (3 мМ) (2), с FeSO4 (10 мкМ) (3), с перекисью водорода (3 мМ) и FeSO4 (10 мкМ) (4).

В целом, полученные результаты свидетельствуют о том, что в водных растворах бикарбонатов спонтанно образуется супероксидный радикал, стационарный уровень которого возрастает при освещении раствора. Таким образом, основной физиологический буфер представляет собой редокс-активную среду.

В Разделе 3.2. описаны эксперименты по изучению ХЛ растворов бикарбонатов. В Подразделе 3.2.1. показано, что в водных растворах бикарбонатов в ответ на добавление солей сульфатного двухвалентного железа FeSO4 (доноров электронов), возникает вспышка люминесценции, затухающая в течение нескольких секунд – нескольких десятков секунд с момента добавления соли. Максимальная амплитуда и светосумма наблюдалась при концентрации Fe(II) 5-10 мкM, однако развитие ХЛ происходило даже при концентрации Fe(II) 0,1 мкМ. Для усиления сигнала ХЛ вместе с Fe(II) в растворы бикарбонатов добавляли ЛМ (неспецифический зонд на АФК). При этом амплитуда вспышки излучения (Fe(II)-ЛМ-зависимая ХЛ) возрастала приблизительно в 10 раз. Оптимальная концентрация ЛМ составляла 5-10 мкМ. При добавлении к растворам бикарбонатов только ЛМ, ХЛ не наблюдается. Реагент Fe(II)-ЛМ использовали в дальнейших экспериментах для изучения влияния различных факторов на реакции, протекающие в водных растворах бикарбонатов.

А

Б

Рисунок 5. Излучение 1 мл свежеприготовленных растворов NaHCO3 (A) (концентрации указаны на графике) при добавлении в раствор реагента Fe(II)-ЛМ (10 мкМ/10 мкМ). Приведены средние значения для 3-х параллельных проб, разброс не выше 5%. Изменение излучения (Б) раствора NaHCO3 (5 мМ ) при его хранении при комнатной температуре.

В подразделе 3.2.2 представлены результаты исследований зависимости сигнала Fe(II)-ЛМ ХЛ от рН. При добавлении реагента Fe(II)-ЛМ в свежеприготовленные растворы NaHCO3 или КHCO3, амплитуда вспышки ХЛ возрастает с ростом концентрации бикарбоната (рис. 5 А). При хранении этих растворов в контакте с воздухом амплитуды вспышек ХМ возрастали (рис. 5 Б). Оказалось, однако, что различия в интенсивности излучения растворов с разной концентрацией НСО3 обусловлено различием в рН этих растворов – чем выше концентрация НСО3 в водном растворе, тем выше значение в нем рН. При хранении водных растворов бикарбонатов в контакте с воздухом значения их рН возрастают.

Для выяснения рН-зависимости интенсивности ХЛ, индуцированной введением в раствор бикарбоната реагента Fe(II)-ЛМ, 5 мМ раствор NaHCO3 титровали NaOH и определяли амплитуду вспышки излучения и светосумму за 60 сек в диапазоне значений рН 7,5 – 10,5. Из графика на рисунке 6 видно, что амплитуда возрастает при увеличении рН до 9, затем резко снижается и вновь начинает расти в щелочной области при рН > 10. Диапазон рН, в котором значения светосумм индуцированных Fe(II) вспышек ХЛ в растворах бикарбонатов максимальны, был сдвинут ближе к рН 8,6. Учитывая, что значения рКа для углекислоты составляют: рКа1=6,35 и рКа2=10,3 (при 25оС), в диапазоне рН, оптимальном для развития индуцированной Fe(II) ХЛ, углекислота в растворе представлена более, чем на 90% бикарбонатом, но несколько процентов ее представлено СО32─.

Для выяснения роли ионов НСО3 и роли рН в развитии индуцированной реагентами ХЛ, реагент Fe(II)-ЛМ вносили в образцы деионизированной воды, рН которой доводили до значений в диапазоне от 8 до 10,5 с помощью Ba(OH)2. В растворах Ba(OH)2 вспышек ХЛ при рН < 9,0 не наблюдалось и ХЛ появлялась лишь при значениях рН > 9,2. Отсутствие ХЛ в растворах Ba(OH)2 при значениях рН, оптимальных для ХЛ растворов бикарбонатов, может объясняться тем, что BaCO3 слабо растворим в воде, и концентрация бикарбоната, образующегося из СО2 воздуха, в них ничтожна.

Рисунок 6. рН─зависимость амплитуд вспышек, индуцированных реагентом Fe(II)-ЛМ (концентрации по 10 мкМ), в растворе NaHCO3 (5 мМ), рН в котором доводили до разных значений NaOH. Представлены средние значения для 3-х параллельных образцов.

  1. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (57)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится "__ " 2008 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 502.006.17 в Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российская академия государственной
  2. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (35)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится 28 мая 2007 года в 15 часов 15 минут на заседании диссертационного совета Д.210.018.01 в Санкт-Петербургской государственной консерватории имени Н.
  3. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (123)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится 16 сентября 2010 г. в часов минут на заседании Совета Д.212.199.06 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата исторических наук при Российском государственном педагогическом университете им.
  4. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (172)

    Автореферат диссертации
    Диссертация выполнена на кафедре национальных, федеративных и международных отношений Российской академии государственной службы при Президенте Российской Федерации.
  5. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (379)

    Автореферат диссертации
    Защита диссертации состоится " " 2008 г. в аудитории М-611 в час. __ мин. на заседании диссертационного совета Д 212.157.02 при Московском энергетическом институте (Техническом университете) по адресу: ул.
  6. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (459)

    Автореферат диссертации
    Актуальность темы исследования определяется необходимостью глубокого научного анализа причин и характера эмиграции россиян в страны Северной Америки в ХХ веке, в результате которой страна потеряла значительную часть своих наиболее активных сограждан.
  7. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (34)

    Автореферат диссертации
    Актуальность диссертации связана с возросшим интересом исследователей к проблемам социального развития российских регионов. К числу наиболее значимых проблем относится модернизация образования - необходимое условие эффективного общественного развития.
  8. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (157)

    Автореферат диссертации
    Диссертация выполнена в Российской академии государственной службы при Президенте Российской Федерации на кафедре правового обеспечения рыночной экономики
  9. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (200)

    Автореферат диссертации
    Защита диссертации состоится «16» октября 2007г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 022.001.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора филологических наук в Институте языка, литературы и искусства им.
  10. Автореферат диссертации на соискание ученой степени (277)

    Автореферат диссертации
    Защита состоится « » 2006 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 002.026.01 при Всероссийском институте научной и технической информации РАН по адресу: 125190, Москва, ул.

Другие похожие документы..